Investigación de las diferencias en la susceptibilidad de las cepas de Campylobacter jejuni a la luz ultravioleta

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9459 (2023) Citar este artículo

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Campylobacter jejuni sigue siendo una alta prioridad en la salud pública en todo el mundo. Actualmente se está explorando la tecnología de diodos emisores de luz ultravioleta (UV-LED) para reducir los niveles de Campylobacter en los alimentos. Sin embargo, han surgido desafíos como las diferencias en las susceptibilidades de las especies y las cepas, los efectos de los tratamientos UV repetidos en el genoma bacteriano y el potencial para promover la protección cruzada antimicrobiana o inducir la formación de biopelículas. Investigamos la susceptibilidad de ocho aislamientos clínicos y de granja de C. jejuni a la exposición a UV-LED. La luz UV a 280 nm indujo diferentes cinéticas de inactivación entre las cepas, de las cuales tres mostraron reducciones superiores a 1,62 log CFU/mL, mientras que una cepa fue particularmente resistente a la luz UV con una reducción máxima de 0,39 log CFU/mL. Sin embargo, la inactivación se redujo en 0,46 a 1,03 log CFU/mL en estas tres cepas y aumentó a 1,20 log CFU/mL en el aislado resistente después de dos ciclos repetidos de UV. Los cambios genómicos relacionados con la exposición a la luz ultravioleta se analizaron mediante WGS. También se encontró que las cepas de C. jejuni con respuestas fenotípicas alteradas después de la exposición a los rayos UV tienen cambios en la formación de biopelículas y susceptibilidad al etanol y los limpiadores de superficies.

Campylobacter spp. son actualmente algunos de los patógenos transmitidos por los alimentos más comunes y se estima que están asociados con aproximadamente 500 millones de casos de campilobacteriosis cada año en todo el mundo. Se ha informado que Campylobacter jejuni es el agente causal en la mayoría de los casos1. La carne de ave a menudo está contaminada (60–80%) con Campylobacter spp. y se considera la principal fuente de infección en humanos. La producción avícola a gran escala ha contribuido a la propagación de C. jejuni entre las parvadas, lo que ha dado lugar a altos niveles de esta bacteria en la carne de ave al por menor. En consecuencia, se han realizado esfuerzos a nivel de granja y procesamiento para reducir la cantidad de C. jejuni en la carne de aves. Se han estudiado varias intervenciones como agentes antimicrobianos, vacunas, agua caliente y tratamiento de canales con vapor como posibles intervenciones en la cadena de producción avícola2.

La luz ultravioleta (UV) ha surgido como una potencial tecnología de desinfección debido a su eficacia en la descontaminación microbiana de superficies, agua y aire. La aplicación de esta tecnología no térmica en alimentos líquidos y superficies alimentarias también ha sido evaluada en el sector agroalimentario, con el objetivo de su futura implementación en la cadena alimentaria3. La luz ultravioleta se encuentra en un rango de longitud de onda específico de 100 a 400 nm en el espectro electromagnético, donde se ha demostrado que la región de 200 a 280 nm, también conocida como UV-C, tiene el máximo efecto de inactivación para una amplia gama de microorganismos. . Los mecanismos de acción de la UV-C están bien descritos en la literatura4,5 e implican la formación de dímeros en el ADN, como los dímeros de pirimidina de ciclobutano (CPD) y los fotoproductos de pirimidina 6–4 pirimidona (6-4PP) que provocan lesiones. Estas lesiones interfieren con la transcripción del ARN y la replicación del ADN, interrumpiendo la función normal de la célula y provocando la muerte celular3,4.

Para la generación de luz ultravioleta, los dispositivos de lámparas de mercurio son ampliamente utilizados en la industria. Sin embargo, el mercurio representa una amenaza tóxica que puede tener un impacto en los seres humanos y el medio ambiente. Por lo tanto, en los últimos años han surgido otras alternativas, como la tecnología de diodos emisores de luz ultravioleta (UV-LED), para superar este problema. Los dispositivos UV-LED presentan otras ventajas a las lámparas de mercurio tales como bajo costo, alta durabilidad, bajas emisiones de calor y energía y flexibilidad, entre otras. A pesar de ello, estos novedosos dispositivos requieren mayor investigación para su potencial implementación como estrategias de desinfección en el sector agroalimentario5,6.

Según Alvarez-Ordonez et al.7, las nuevas tecnologías de procesamiento empleadas para la descontaminación de alimentos, como la luz ultravioleta, pueden desencadenar una respuesta adaptativa en algunas bacterias y dar lugar a células más persistentes debido a la subletalidad característica del estrés. Así, la eficacia de la desinfección puede verse reducida tras varios tratamientos con la misma tecnología7. En particular, se ha documentado que los tratamientos con luz ultravioleta se ven afectados por la tasa de crecimiento microbiano, las propiedades ópticas de la matriz y la cepa microbiana y las diferencias entre especies. Esto último puede ser relevante al evaluar la efectividad de la luz ultravioleta donde se ha demostrado una alta variabilidad en la resistencia a los rayos ultravioleta en cepas de la misma especie8. Por ejemplo, Haughton et al.9 observaron una variación considerable en la cinética de inactivación de 10 cepas de Campylobacter cuando se aplicaron una lámpara UV y dispositivos UV-LED. Otro estudio también identificó diferentes susceptibilidades entre las cepas de Listeria monocytogenes expuestas a la luz ultravioleta, pero la fase de crecimiento no influyó en la susceptibilidad10. La evidencia de la variabilidad específica de la cepa para resistir la luz ultravioleta sugiere que se requiere más información para comprender este fenómeno y respaldar las perspectivas futuras de la implementación de UV-LED11. Existen otros desafíos con respecto al uso de esta tecnología, incluidos los efectos del tratamiento UV repetido en la susceptibilidad de las células bacterianas, la formación de biopelículas y/o la coselección para disminuir la susceptibilidad a los desinfectantes. Aunque la asociación entre la formación de biopelículas y la resistencia a los rayos UV en las células bacterianas después de la exposición a los rayos UV está poco explorada, se ha demostrado que la resistencia a la luz UV tiene efectos de protección cruzada contra factores estresantes como el etanol, el ácido, el calor y el peróxido de hidrógeno. Sin embargo, los estudios que evalúan este fenómeno de protección cruzada no son suficientes para sacar conclusiones firmes7,10,11,12.

Los objetivos de este estudio fueron: (i) investigar la susceptibilidad de ocho aislamientos de campo de C. jejuni y una cepa de referencia a una exposición única a la luz UV-LED (UV280), y cuatro de las primeras cepas a una exposición repetida a la luz UV280 basada en en su susceptibilidad UV observada (ii) para examinar cualquier alteración genómica observada después del tratamiento mediante secuenciación del genoma completo (WGS), (iii) para evaluar si el tratamiento con UV280 podría resultar en una mayor resistencia a los productos químicos desinfectantes o inducir la formación de biopelículas.

Los efectos de la exposición a UV280 durante 1, 3, 5, 7 y 11 min en nueve cepas de C. jejuni se presentan en la Fig. 1. En general, todas las cepas de C. jejuni estudiadas mostraron reducciones superiores a 0,8 Log CFU/mL después 11 min de exposición a la luz UV, excepto NCTC 11168, que fue particularmente resistente al efecto de inactivación UV, con una reducción máxima de 0,39 ± 0,23 Log CFU/mL. MF6671 fue la cepa más susceptible a la exposición a la luz ultravioleta con las reducciones bacterianas más altas (1,62 ± 0,33 Log CFU/mL), seguida de MF716 (1,59 ± 0,37 Log CFU/mL) y MF13415 (1,51 ± 0,19 Log CFU/mL). Se observaron diferencias en la cinética de inactivación entre estas cepas cuando se aplicó UV a 280 nm. Siete de las nueve cepas fueron resistentes a los tratamientos con luz ultravioleta más prolongados, de modo que un período de tratamiento de 11 min no resultó en reducciones bacterianas significativamente mayores que los tiempos de tratamiento más bajos (p ≥ 0,05).

Reducciones bacterianas (Log UFC/mL) observadas en las nueve cepas de C. jejuni antes y después de la exposición UV a 280 nm durante 0, 1, 3, 7, 9 y 11 min. Las diferencias estadísticas entre tratamientos se indican con * (p < 0,05).

Se seleccionaron las cepas MF6671, MF13415, 5.33 AP y NCTC 11168 debido a sus diferentes cinéticas de inactivación bajo luz UV a 280 nm, como se muestra en la Fig. 1. Para evaluar el efecto de la exposición UV repetida en estas cepas, las reducciones bacterianas después de una doble El tratamiento UV se comparó con las reducciones del tratamiento único (ver Fig. 2). Sorprendentemente, la eficacia del segundo tratamiento con UV280 disminuyó significativamente cuando se aplicó durante 1 min a las cepas MF6671 (de 1,81 a 0,78 Log CFU/mL) y MF13415 (de 1,43 a 0,78 Log CFU/mL), y 11 min a MF13415 ( de 1,51 a 1,05 Log UFC/mL) (p < 0,05). Además, se observó el efecto contrario para 5,33 AP, con reducciones que aumentaron de 0 a 0,49 Log CFU/mL después de 1 min de exposición y de 1,23 a 2,35 Log CFU/mL después de 11 min de exposición (p < 0,05). NCTC 11168 tuvo un aumento en las reducciones bacterianas de 0,39 a 1,05 Log CFU/mL después de 11 minutos de exposición (p < 0,05). Por lo tanto, el tratamiento repetido con UV280 aumentó significativamente la susceptibilidad de las últimas cepas. Además, se demostró que los tratamientos de 11 min con UV280 reducen la tolerancia de las cepas de C. jejuni tratadas durante 2 ciclos UV que las tratadas durante 1 min (p < 0,05).

Reducciones bacterianas (Log UFC/mL) observadas en las cuatro cepas de C. jejuni seleccionadas cuando se sometieron a uno o dos ciclos de UV a 280 nm durante 1 y 11 min. Las diferencias estadísticas entre los tratamientos se indican con * (p < 0,05).

Se realizó un análisis WGS para investigar las posibles diferencias en los genomas de las cepas de C. jejuni que mostraban diferentes cinéticas de inactivación antes y después del tratamiento con UV. El pangenoma de las 9 cepas de C. jejuni se presenta en la Fig. 3. En el genoma central de estas cepas, se encontraron 12 334 llamadas de genes y 1356 grupos de genes. Además, el genoma total constaba de 2173 grupos de genes y 15414 genes. El pangenoma de estas cepas mostró dos grupos, de los cuales se agruparon las cepas MF6671, MF13415, 5.33 AP y C16, así como las cepas NCTC 11168, A28f64, MF716, A21f105 y MF701989. El origen y la fuente de las cepas aisladas no influyeron en la agrupación.

Análisis de árbol de conglomerados de pangenomas de cepas de C. jejuni y origen y origen de los aislamientos incluidos con nueve cepas no sujetas a luz ultravioleta.

Las mutaciones potenciales en el genoma de las cepas de C. jejuni tratadas con UV se analizaron utilizando Snippy para comparar los genomas tratados con UV con los no tratados. En la Fig. 4 se presenta un mapa de calor de mutaciones basado en SNP e indeles. Las mutaciones en regiones de secuencia no codificante (CDS) o aquellas que afectan a proteínas hipotéticas no se consideraron y se pueden encontrar en el material complementario (Tabla complementaria S.1). En general, las mutaciones inducidas por UV ocurrieron independientemente del tiempo de tratamiento en el genoma de NCTC 11168, 3.55 AP y el gen apt en MF6671 y MF13415, que codifica la adenina fosforribosiltransferasa, cuando se expuso a la luz UV a 280 nm durante 1 u 11 min. Además, se observaron igualmente mutaciones debidas a SNP, deleciones e inserciones. Cada gen mutado se asignó a una vía KEGG para investigar el impacto potencial de la luz ultravioleta en el funcionamiento y las estructuras bacterianas. Se encontró que NCTC 11168 tiene el mayor número de mutaciones, con una amplia gama de vías metabólicas, estructuras y funciones afectadas por la exposición a los rayos UV y con una respuesta idéntica, a pesar de estar sujeto de forma independiente a diferentes tiempos de exposición a los rayos UV (Fig. 4). Se encontró una mutación SNP en el gen waaA (biosíntesis y metabolismo de glicanos) en la cepa 5.33 AP expuesta a UV durante 1 min, a diferencia de la misma cepa tratada durante 11 min. Además, se detectaron otras mutaciones en genes asociados con la traducción y el metabolismo de carbohidratos, cofactores y vitaminas cuando 5.33 AP se sometió a ambos tiempos de exposición. Después de la exposición a los rayos UV, el gen apt implicado en el metabolismo de los nucleótidos presentó una mutación en las cepas MF6671 y MF13415. En estas dos cepas se encontraron otras mutaciones en genes relacionados con el metabolismo de carbohidratos y aminoácidos, ensamblaje flagelar y replicación y reparación.

Se presenta un mapa de calor de los hallazgos de Snippy para cepas seleccionadas de C. jejuni sometidas a UV a 280 nm durante 1 y 11 min, donde se muestra el tipo de mutación: polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), inserciones y deleciones; y rutas KEGG incluidas para cada gen mutado.

Se evaluó el crecimiento de biopelículas de Campylobacter en medios ricos en nutrientes (TSB) y pobres en nutrientes (M9) en condiciones aeróbicas y microaeróbicas a dos temperaturas diferentes (37 y 4 °C), y los resultados se evaluaron después de 24 h de incubación. . Este protocolo se repitió con cultivos expuestos a UV280 durante 7 min. La formación de biopelículas más intensa se observó en cada aislamiento de C. jejuni cuando se cultivó en un medio rico en nutrientes a 37 °C en condiciones microaeróbicas y los resultados se resumen en la Tabla 1. De los 9 aislamientos, tres de ellos mostraron la capacidad de formar biopelículas fuertes a bajas temperaturas en ausencia de concentraciones ambientales de oxígeno, mientras que la baja disponibilidad de nutrientes contribuyó a la formación de biopelículas más débiles en la mayoría de los aislamientos. Sin embargo, la cepa de referencia C. jejuni NCTC 11168 y los aislados C16, MF701989, MF13415, MF6671, 5.33 AP y a28f64 mostraron cierta formación moderada de biopelículas a 37 °C en condiciones microaeróbicas en medio con nutrientes limitados (M9). En condiciones aeróbicas a 4 °C, se observó una formación de biopelícula más fuerte en los medios ricos en solo un aislado (a21f105), mientras que se observó una formación de biopelícula moderada en otros dos aislados (C16 y MF701989). En las mismas condiciones, se observó una débil formación de biopelículas en la mayoría de los aislamientos de Campylobacter con baja abundancia de nutrientes.

Los aislamientos tratados con luz ultravioleta mostraron una capacidad reducida para formar biopelículas en comparación con los aislamientos no tratados en cada una de las condiciones utilizadas en este estudio. Las condiciones de crecimiento con abundantes nutrientes (TSB), temperaturas más cálidas (37 °C) y la presencia de oxígeno dieron como resultado el mayor crecimiento de biopelículas en las células tratadas con UV280, aunque la capacidad de formación de biopelículas fue aún menor en las células no tratadas para todas las cepas, con la excepción de aísla a28f64 y MF6671. La baja temperatura de crecimiento y la baja abundancia de nutrientes (medio M9) dieron como resultado reducciones significativas (p < 0,05) en la formación de biopelículas después del tratamiento con UV para todos los aislamientos, con la excepción de a21f105. El tratamiento con UV280 redujo significativamente (p < 0,05) la formación de biopelículas en todas las condiciones para cada aislamiento investigado (Tabla 1).

En la Tabla 2, 3 de 9 cepas mostraron susceptibilidad al etanol, lejía doméstica (hipoclorito de sodio) y soluciones limpiadoras de superficies domésticas antes del tratamiento UV de las suspensiones celulares, con la excepción de C16, 5.33 AP, NCTC 11168. Además, el antimicrobiano el efecto de estas soluciones se redujo en la mayoría de las cepas de C. jejuni cuando se expusieron a 4 °C. Mientras que las cepas MF13415 y NCTC 11168 no mostraron actividad celular a 4 °C, otras cepas, incluidas A21F105, C16, MF701989, MF716 y a28f64, mostraron una mayor resiliencia frente a los compuestos estudiados, incluso a las concentraciones de trabajo recomendadas. La aplicación de tecnología UV-LED mejoró o mantuvo la eficacia de inactivación de estos desinfectantes en 5 de 9 cepas. Sin embargo, el aislado C16 a 42 °C mostró una sensibilidad reducida al etanol después del tratamiento con UV, mientras que solo el limpiador a base de tensioactivo mostró un efecto contra el MF716 tratado con UV a 42 °C. De manera similar, la resistencia a los limpiadores a base de EtOH y NaOCl fue mayor en las células tratadas con UV de MF6671 y en MF701989 a EtOH y al limpiador de superficies (Tabla 2). En particular, también se observó una mayor susceptibilidad a EtOH después del tratamiento con UV en los aislamientos MF13415, NCTC 11168 y, especialmente, 5.33 AP, que fue más susceptible a cada clase de antimicrobiano probado. Esto es notable ya que las suspensiones sin tratar de 5.33 AP mostraron una mayor resiliencia cuando se emplearon agentes desinfectantes. La exposición a la luz ultravioleta y la incubación a 4 °C dieron como resultado una mayor susceptibilidad de a21f105 al etanol, y MF701989 y 5.33 AP al NaOCl, pero al mismo tiempo MF701989 mostró una mayor resiliencia al limpiador de superficies y MF6676 a todas las soluciones evaluadas (Tabla 2 ). Curiosamente, los tipos salvajes MF13415 y NCTC 11168 no mostraron supervivencia a 4 °C, pero las cepas mutadas pudieron sobrevivir a esta temperatura.

La aplicación de la tecnología UV-LED para reducir el número de Campylobacter en líquidos, superficies y alimentos se ha investigado previamente en otros estudios13,14,15. Sin embargo, según los conocimientos de los autores, las diferencias en la cinética de inactivación bacteriana después del tratamiento con UV solo han sido evaluadas por Haughton et al.14, Haughton et al.9 y en el presente estudio. El primer estudio observó que las diferentes susceptibilidades entre aislados de Campylobacter frente a la luz ultravioleta a 395 nm en medio transparente eran resultado del efecto biológico y no de algún factor de atenuación de la intensidad de la luz14. Para evaluar la susceptibilidad de Campylobacter a UV-LED en nuestro estudio y comparar las susceptibilidades de las cepas, fue necesario modificar la absorbancia del medio para reducir la penetración de la luz UV y la alta efectividad de descontaminación de la tecnología UV-LED en medios líquidos transparentes. . En comparación con Haughton et al.14, las reducciones bacterianas logradas en el presente estudio fueron 6 log más bajas (Fig. 1). Esto puede ser consecuencia de la reducción de la penetrabilidad de la luz UV en el medio que puede proteger a las células bacterianas y favorecer su supervivencia13. En el estudio de Haughton et al.9, las suspensiones de C. jejuni en una mezcla de MRD y leche descremada UHT se trataron con un dispositivo de lámpara UV a 254 nm y se observaron reducciones de hasta 6 log CFU/mL para los 10 aislamientos de Campylobacter , observándose una reducción de 3,5 log UFC/mL para la cepa menos susceptible. Aunque las reducciones fueron menores en nuestro estudio (≤ 1,6 log UFC/mL), probablemente debido a un mayor contenido de grasa (2%) en la matriz de la leche o a la diferencia en las longitudes de onda UV, también se observaron diferencias en la inactivación en todas las cepas estudiadas después exposición a los rayos ultravioleta. El análisis del pangenoma de las 9 cepas de C. jejuni dio como resultado dos grupos independientes de la fuente y el origen de los aislamientos. Otros autores, como Thépault et al.16, Wilson et al.17 y Méric et al.18 investigaron el pangenoma de aislados de C. jejuni con el objetivo de correlacionar su origen y fuente. Encontraron esta tarea desafiante debido al alto nivel de diversidad genotípica.

Las cepas más notables en base a las altas variaciones observadas en la cinética de inactivación fueron seleccionadas y sometidas a dos ciclos de tratamiento con luz UV a 280 nm. Curiosamente, los tratamientos repetidos con luz ultravioleta a 280 nm tuvieron el efecto opuesto en las reducciones de C. jejuni en las cepas estudiadas en comparación con los tratamientos únicos con luz ultravioleta. Por lo tanto, las cepas más susceptibles después de un solo tratamiento con UV tenían una mayor resistencia después de dos ciclos de UV y viceversa. Álvarez-Molina et al.21 investigaron el proceso de adaptación de Escherichia coli, Salmonella spp. y Listeria monocytogenes a la luz UV después de 10 ciclos UV repetidos y observaron que las células bacterianas eran más resistentes a la luz UV después. Estos autores sugirieron que este fenómeno puede ser consecuencia de la mutagénesis adaptativa cuando las células son sometidas a estrés subletal19. Aunque se hicieron observaciones similares para MF6671 y MF13415 después de dos ciclos UV, la mayor susceptibilidad a la luz UV encontrada en las cepas NCTC 11168 y 5.33 AP contrasta con la primera. Es importante señalar que MF6671 y MF13415 fueron las cepas más susceptibles a la luz ultravioleta y 5.33 AP y NCTC 11168 fueron las cepas más resistentes cuando se sometieron a un solo tratamiento con luz ultravioleta. Por lo tanto, una correlación entre ambos efectos puede ser posible. Sin embargo, actualmente no hay suficiente información disponible en la literatura científica para llegar a ninguna conclusión. Las disimilitudes detectadas en los alineamientos de los aislados tratados con UV pueden deberse a mutaciones sin sentido inducidas en el genoma bacteriano. Para verificar esto, se realizó un análisis Snippy comparando el genoma de las cepas tratadas con UV con las no tratadas. Las cepas NCTC 11168 y 3.55 AP, que fueron más susceptibles después de dos ciclos de UV, presentaron mutaciones en genes asociados con la transducción y traducción de señales. Por el contrario, se observaron mutaciones en los genes flip y fliR (que codifican las proteínas biosintéticas flagelares FliP y FliR) en cepas que eran más resistentes a la luz UV después de dos ciclos UV y están relacionadas con la motilidad y la colonización del huésped20. Estos autores sugirieron que estas mutaciones reversibles son un mecanismo adaptativo para mantener la estabilidad del genoma (robustez del genoma) en Campylobacter spp. en respuesta a factores de estrés como UV20. En nuestro estudio también se identificó una mutación en el gen fdtA (que codifica para TDP-4-oxo-6-desoxi-alfa-d-glucosa-3,4-oxoisomerasa), que se ha relacionado con la adhesión y colonización de E. coli21. Sin embargo, la función de este gen no se había descrito antes en C. jejuni. Además, las mutaciones en los genes purF (que codifican para la amidofosforribosiltransferasa) y apt que se encuentran en las cepas menos susceptibles de este estudio están asociadas con un nuevo mecanismo adaptativo de C. jejuni para aumentar su probabilidad de supervivencia, basado en promover la heterogeneidad genética de la población bacteriana22. Por último, una mutación en el gen ung, que codifica para la uracil-DNA glicosilasa, observada en este estudio, también fue detectada previamente en otros estudios23,24. Aunque este gen se asoció con el inicio de la vía de reparación por escisión de bases (BER), mecanismos inducidos por el estrés UV, Gaasbeek et al.24 y Dai et al.23 concluyeron que la mutación de este gen no promueve la reparación del daño del ADN o la recombinación. reparación en C. jejuni. Así, las cepas de C. jejuni más resistentes a los UV presentaron mutaciones vinculadas a mecanismos de supervivencia.

Para el análisis de formación de biopelículas realizado en este estudio, se observaron variaciones en la resistencia y presencia/ausencia de biopelículas en cepas de C. jejuni no tratadas para las diferentes condiciones estudiadas (4 y 37 °C; aeróbicas y microaeróbicas; medios ricos y pobres en nutrientes). ). La variabilidad de las cepas en la formación de biopelículas ya se ha observado para otros patógenos transmitidos por los alimentos25. Estos autores indicaron que se requiere más investigación para evaluar la formación de biopelículas bacterianas en condiciones más realistas25. Por lo tanto, nuestro estudio demostró la variabilidad de la cepa de C. jejuni en la formación de biopelículas, incluso en ambientes fríos, microaeróbicos o pobres en nutrientes. En general, la luz ultravioleta disminuyó la producción de biopelículas en la mayoría de las cepas estudiadas, observándose mayores reducciones en presencia de estrés adicional (4 °C y medio nutritivo deficiente). Algunos de los genes mutados mencionados anteriormente (flhA, rcsC, mreB y waaA) en NCTC 11168 y 5.33 AP pueden estar asociados con la formación de biopelículas, ya que están asociados con la motilidad celular, la morfología y la formación de peptidoglicanos26,27,28,29. Según Luo et al.30, la tecnología de luz ultravioleta se ha evaluado principalmente para la inactivación de microorganismos que ya se encuentran dentro de las biopelículas formadas. Sin embargo, existen algunos estudios que investigan la luz ultravioleta como tratamiento para prevenir la formación de biopelículas30. Los estudios que investigaron el uso de UV para prevenir la formación de biopelículas por parte de las células de E. coli y Pseudomonas aeruginosa tuvieron éxito en este sentido31,32,33. Sin embargo, el efecto disruptivo de la luz ultravioleta en el proceso de formación de biopelículas puede no durar mucho34. Los cultivos bacterianos en el presente estudio se incubaron durante solo 24 h y, por lo tanto, se requiere más investigación para evaluar esta preocupación.

La actividad antimicrobiana del EtOH y de los limpiadores de superficies seleccionados se redujo cuando las bacterias se sometieron a bajas temperaturas. Esta actividad de biocidas dependiente de la temperatura ha sido ampliamente demostrada por varios autores35 para la mayoría de los limpiadores de superficies domésticos e industriales. En concordancia con nuestro estudio, Bakht et al.36 observaron variaciones en la susceptibilidad antimicrobiana a biocidas, como EtOH 70% y NaOCl 5% en 120 cepas de P. aeruginosa, de las cuales 59 fueron resilientes a EtOH 8,75% y 33 cepas a NaOCl 0,08. % En el presente estudio, EtOH al 70 % y NaOCl al 2 % no inactivaron la cepa 5.33 AP C. jejuni a 42 ℃. Al mismo tiempo, C16 y NCTC 11168 fueron resistentes a una concentración del 2 % de NaOCl en las mismas condiciones. Un tratamiento con luz ultravioleta previa a la exposición al biocida demostró mejorar o mantener la eficacia antimicrobiana de los biocidas seleccionados en la mayoría de las cepas. El efecto inhibidor combinado de la luz UV junto con EtOH o NaOCl se ha observado para otras bacterias patógenas como E. coli, Bacillus cereus, Cronobacter sakazakii, S. Typhimurium, entre otras37,38,39. Sin embargo, 4 cepas de C. jejuni mostraron una mayor tolerancia a al menos uno de los biocidas estudiados después del tratamiento con UV en el presente estudio. La presencia de genes mutados apt y purF en MF6671, que se identificó como una cepa tolerante a los limpiadores basados en EtOH y NaOCl después de la exposición a los rayos UV, puede aumentar la tolerancia al estrés de estas bacterias. Por lo tanto, las células de C. jejuni con genes de biosíntesis de purina mutados (purF y apt) fueron más tolerantes al estrés hiperosmótico. Este fenómeno puede ser causado por un mecanismo de protección cruzada que podría desarrollarse debido a la naturaleza mutagénica de la luz UV40. Hartke et al.41 estudiaron el efecto del pretratamiento con UV de 254 nm en Lactococcus lactis y encontraron que los cultivos bacterianos aumentaron la tolerancia al 20% (v/v) de etanol, calor (52 °C) y H2O2 (15 mM). Estos autores sugirieron que puede estar ocurriendo una vía de regulación superpuesta entre los rayos UV y otros estreses41. Hasta donde sabemos, faltan estudios que hayan encontrado una protección cruzada de la luz ultravioleta frente a biocidas industriales y domésticos comunes como EtOH y NaOCl. La investigación futura debe centrarse en comparar los hallazgos de este estudio con el análisis transcriptómico para comprender mejor los efectos de la luz ultravioleta en el genoma bacteriano, las mutaciones inducidas y su vínculo con la protección cruzada.

Se obtuvieron un total de 8 aislamientos de campo de C. jejuni y una cepa de referencia (NCTC 11168) de la colección de cultivos de microbiología en Teagasc Food Research Centre, Ashtown (Dublín, Irlanda). Las cepas se aislaron de diferentes fuentes (origen clínico y de granja) como se muestra en la sección de datos ampliados y se almacenaron en sangre de caballo desfibrinada (Cruinn diagnostics limited, Dublín, Irlanda) a -80 °C. La preparación de los aislamientos consistió en la reanimación de las cepas bacterianas en placas de agar Mueller Hinton (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) y la posterior incubación a 42 °C durante 48 h en una atmósfera microaeróbica. Las colonias se sembraron en agar desoxicolato de cefoperazona de carbón vegetal modificado (mCCDA, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) suplementado con suplemento de crecimiento de Campylobacter (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). Después de incubar microaeróbicamente durante 48 h a 42 °C, las colonias aisladas se inocularon en 30 ml de caldo Mueller Hinton (MHB) (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) y las suspensiones se incubaron durante 48 h a 42 °C en condiciones microaeróbicas.

Las suspensiones de células bacterianas se centrifugaron a 4000 × g durante 15 min y se lavaron dos veces con 30 ml de diluyente de recuperación máxima (MRD, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). Se logró una concentración final de C. jejuni de ~ 5 log CFU/mL en 20 mL de leche de tratamiento ultra alto (UHT) (2% de grasa) diluida en MRD (1:4, v:v) para reducir la La penetrabilidad de la luz ultravioleta en el medio y ayuda a la supervivencia de las células9. Las suspensiones bacterianas (20 mL) se vertieron en placas de Petri con una profundidad de líquido de ~ 6 mm y una capacidad de volumen de 24 cm3 (altura: 1,3 cm y diámetro: 5,8 cm) y se colocaron en el centro de la cámara LED a una distancia de 5 cm de la fuente de luz Las suspensiones bacterianas se trataron con un dispositivo UV-LED (PearlLab Beam, Aquisense technologies, NC, EE. UU.) a una longitud de onda de 280 nm durante 1, 3, 5, 7, 9 y 11 min. Se proporciona una descripción detallada del dispositivo UV-LED y se seleccionó la longitud de onda de 280 nm por su alto efecto de inactivación15,42. Las muestras no tratadas actuaron como controles. La dosis de UV280 se calculó multiplicando la tasa de fluencia medida de la luz (W/cm2) por el tiempo de tratamiento en min. La tasa de fluencia de la luz UV se midió usando un radiómetro (Opticalmeter, modelo ILT2400, International light technologies, MA, EE. UU.) y se confirmó como 0,041 W/cm2. Las dosis de luz UV para cada tiempo de tratamiento se proporcionan en la sección de datos ampliados.

Inmediatamente después del tratamiento con UV, se determinaron los niveles de C. jejuni en las suspensiones de muestras de control y tratadas con UV para cada cepa. Se prepararon diluciones seriadas de diez veces en MRD y se sembraron alícuotas de 0,1 ml en placas de mCCDA. Después de la incubación durante 48 h a 42 °C en condiciones microaeróbicas, se enumeraron las colonias bacterianas y se determinaron los recuentos promedio de las muestras tratadas y de control. Las reducciones bacterianas se calcularon restando los recuentos de C. jejuni de la muestra tratada de los no tratados expresados en unidades Log CFU por ml de suspensión.

Se seleccionaron cuatro cepas de C. jejuni para análisis adicionales debido a su susceptibilidad diferente a la luz ultravioleta: cepas MF6671, MF13415, NCTC 11168 y 5.33 AP. Las suspensiones de cepas se prepararon como se detalla anteriormente, con 1 ml de suspensión inoculada en 9 ml de MRD. Estas suspensiones de ~ 5 log CFU/mL se trataron con UV280 durante 6 s a una distancia de 5 cm de la fuente para reducir la población total de Campylobacter de todas las cepas probadas en un 48–61 % (enumeradas como se indicó anteriormente). Las colonias supervivientes después del tratamiento con UV280 se cultivaron en MHB y se incubaron microaeróbicamente durante 48 ha 42 °C. Después de la incubación, las suspensiones se inocularon en una mezcla de leche MRD y UHT, como se detalla anteriormente. En este caso, se seleccionaron tiempos de exposición de 1 y 11 min con UV280 para tratar suspensiones de leche y MRD debido a sus diferentes cinéticas de inactivación. Las muestras no tratadas sirvieron como controles. La enumeración de los sobrevivientes de las cuatro cepas de C. jejuni se realizó para todas las muestras de tratamiento y control con el procedimiento descrito anteriormente.

La extracción de ADN de las cepas MF6671, MF13415, NCTC 11168 y 5.33 AP se realizó a partir de colonias que crecieron en placas de mCDDA después de la exposición a UV280 durante 1 y 11 minutos usando el kit DNeasy® Blood & Tissue (Qiagen, Manchester, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. instrucciones. La pureza del ADN extraído se evaluó con un espectrofotómetro NanodropTM 1000 (ThermoFisher Scientific, Eaton Socon, Reino Unido) y las concentraciones de ADN se determinaron con un fluorómetro Qubit 4.0 (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Eaton Socon, Reino Unido). La secuenciación se llevó a cabo en el centro de secuenciación del Teagasc Food Research Centre Moorepark (Fermoy, Irlanda). La preparación de las bibliotecas de ADN se llevó a cabo con el kit Illumina DNA prep (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se realizó la secuenciación por 2 × 150 pb mediante el sistema NextSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) con reactivos P2.

Se obtuvieron secuencias sin procesar para cada cepa probada. Las secuencias sin procesar de las cepas de prueba no tratadas con UV280 se obtuvieron de un estudio anterior realizado por Truccollo et al.43 y la secuencia sin procesar de C. jejuni NCTC 11168 se recuperó de la base de datos NCBI (BioProject PRJNA8). La limpieza fue un proceso sistémico realizado con Trimmomatic (v0.3.8) después de quitar adaptadores, lecturas que contenían más del 10 % de bases indeterminadas (N > 10 %) y lecturas de baja calidad con un Qscore menor o igual a 5 (Qscore ≤ 5) en un Se eliminó el 50% del total de bases. Después de la limpieza, la calidad de las lecturas se evaluó con FastQC (v0.11.8) en combinación con los programas MultiQC (v1.9)44,45. Antes de continuar, la identificación de las cepas se realizó con Kraken 2 (v2.0.7 beta) a través de la base de datos estándar de Kraken 246. El ensamblaje de lecturas en contigs y scaffolds se realizó mediante SPAdes (v3.13.0) con la opción –careful. La calidad de los andamios se evaluó mediante QUAST (v5.1.0) y MultiQC45,47,48. Para visualizar el pangenoma de las cepas de C. jejuni estudiadas, se empleó el flujo de trabajo anvi'o (v7.1) en los archivos scaffold.fasta ensamblados obtenidos de cepas no tratadas y tratadas (https://merenlab.org/2016/11 /08/pangenomics-v2/; consultado el 23 de noviembre de 2022)49. Los archivos anteriores se convirtieron en bases de datos anvi'o contig a través del programa 'anvi-gen-contigs-database'. Después de este paso, la identificación de genes en scaffolds se realizó con Prodigal para detectar marcos de lectura abiertos y su anotación se realizó utilizando la base de datos Clusters of Orthologous Groups del NCBI (programa 'anvi-run-ncbi-cogs')50,51 hacia cuatro Perfiles HMM de anvi'o proporcionados por modelos ocultos de Markov (programa 'anvi-run-hmms'). Para construir el pangenoma, se determinaron las similitudes de la secuencia de aminoácidos y se compararon dentro de todos los genomas con NCBI blastp. Se emplearon heurísticas Minbit de 0,552 para eliminar coincidencias débiles entre secuencias de aminoácidos y se utilizó el algoritmo MCL (programa 'anvi-pan-genome')53 para identificar grupos.

Los genomas de las cepas tratadas con UV se compararon con las cepas no tratadas utilizando Snippy (v4.3.6), que establece diferencias basadas en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y pequeñas inserciones y deleciones (indels), también conocidas como "llamadas de variantes"54.

Los aislados de C. jejuni se cultivaron durante la noche en caldo de infusión de cerebro y corazón con sangre de caballo desfibrinada al 0,5 % (v/v). Se utilizó un tratamiento previamente evaluado de UV280 para exponer estas suspensiones bacterianas durante 7 min. Posteriormente, estas suspensiones se utilizaron para el ensayo de formación de biopelículas. Las muestras no tratadas sirvieron como controles. Los aislados se dividieron en alícuotas en tubos Eppendorf y se centrifugaron a 13.000 xg durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el sedimento en medio Ringer estéril (Oxoid, Ltd., Basingstoke, Reino Unido). Esto se centrifugó de nuevo y se descartó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en caldo Tryptic Soya (Oxoid, Ltd., Basingstoke, Reino Unido) y medio M9 (MP Biomedicals Germany LLC., Eschwege, Alemania) y se añadió por duplicado de 200 µl a una placa estéril de 96 pocillos. Se prepararon cuatro placas idénticas y cada una se incubó en una de cuatro condiciones: 37 °C en concentraciones ambientales de oxígeno, 37 °C en condiciones microaeróbicas, 4 °C en concentraciones ambientales de oxígeno y 4 °C en condiciones microaeróbicas. Después de 24 h, se retiró el medio y las biopelículas formadas se analizaron utilizando un protocolo de tinción con cristal violeta55. Los parámetros para la fuerza de formación de biopelículas se basaron en la prueba lógica: X > 1,"+++++", X > 0,8, "++++", X > 0,6, "+++", X > 0,3, "++", X > 0,1, "+", H90 < 0,1, "-", donde X es la densidad óptica (DO) a 600 nm.

Los aislados de Campylobacter jejuni se cultivaron durante la noche en caldo de infusión de cerebro y corazón con sangre de caballo desfibrinada al 0,5 % (v/v). Las suspensiones se trataron con UV280 durante 7 min y las muestras de control no se trataron. La evaluación de la resistencia a los antimicrobianos se realizó siguiendo a Balouiri et al.56. Brevemente, las suspensiones bacterianas cultivadas durante la noche en caldo Muller-Hinton se diluyeron a una DO600 = 0,1 y, posteriormente, se usó 1 ml de esta suspensión para inocular agar Mueller Hinton fundido a 45 °C (5 % de sangre de caballo desfibrinada en agar Mueller Hinton). Una vez fraguadas, alícuotas de 10 µl de soluciones que contengan las concentraciones de trabajo de compuestos desinfectantes industriales comunes, incluido 70 % (v/v) de etanol (EtOH) (Sigma-Aldrich Ltd., Arklow, Irlanda), lejía doméstica (< 5 % de lejía a base de cloro). hipoclorito de sodio al 2 %) (Milton®, Procter & Gamble, EE. UU.) y limpiador de superficies doméstico (5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona y 2-metil-2H-isotiazol-3-ona ) (2Work Multi-Surface Cleaner, 2Work Supplies, Sheffield, Reino Unido) y el 50 % de estas concentraciones se agregaron a la placa con el fin de imitar los eventos de dilución en un entorno industrial o doméstico. Después de 48 h de crecimiento a 42 °C en condiciones aeróbicas y microaeróbicas, se evaluó el crecimiento bacteriano en presencia de estos compuestos antimicrobianos56.

Los tratamientos con luz UV se realizaron por duplicado y se evaluaron tres experimentos independientes (N = 6). La normalidad de los datos se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la comparación de las muestras tratadas y de control se realizó mediante un análisis factorial de varianza (ANOVA) para cada una de las cepas de C. jejuni. Las diferencias estadísticas se obtuvieron utilizando la prueba post hoc de Tukey a un nivel α < 0,05. Se empleó el programa GraphPad Prism (GraphPad Prism versión 8.4.2 Inc, San Diego, CA, EE. UU.) para realizar el análisis estadístico y crear los gráficos presentados. La visualización del pangenoma se realizó y editó con la interfaz interactiva anvi'o y el programa 'anvi-display-pan'. Los hallazgos de Snippy se visualizaron usando R (v4.2.1; 2022-06-23) y RStudio (v2021.09.2) junto con el paquete pheatmap (v1.0.12). La calidad del pangenoma y las figuras recortadas se mejoró con Affinity Designer (v1.8.5.703, Serif).

Los datos secuenciados sin procesar de los 8 aislamientos de C. jejuni se obtuvieron del conjunto de datos de BioProject ID PRJNA688841 y el conjunto de datos sin procesar de los aislamientos tratados con UV de este estudio se puede encontrar bajo BioProject ID PRJNA906059.

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Este estudio fue apoyado por el Departamento de Agricultura, Alimentación y Marina (DAFM) bajo el programa Food Institutional Research Measure (FIRM) [Número de concesión: DAFM/17/F/275]. Arturo B. Soro cuenta con el apoyo del programa de becas Teagasc Walsh. Los autores quieren agradecer a la Dra. Fiona Crispie y al Dr. Gaston Allendez por secuenciar nuestras muestras.

Centro de Investigación de Alimentos Teagasc, Ashtown, D15 DY05, Dublín, Irlanda

Arturo B. Soro, Daniel Ekhlas, Declan J. Bolton, Catherine M. Burgess y Brijesh K. Tiwari

Facultad de Medicina Veterinaria de la UCD, University College Dublin, Belfield, D04 V1W8, Irlanda

Arturo B. Soro, Daniel Ekhlas y Paul Whyte

Infectious Diseases in Humans, Service Foodborne Pathogens, Sciensano, J. Wytsmanstraat 14, 1050, Bruselas, Bélgica

Arturo B Soro

Facultad de Agricultura y Ciencias de la Alimentación de la UCD, University College Dublin, Belfield, D04 V1W8, Irlanda

Matthew Marmion y Amalia Gerente General Scannell

Centro UCD para la Seguridad Alimentaria, University College Dublin, Belfield, D04 V1W8, Irlanda

Matthew Marmion y Amalia Gerente General Scannell

Instituto UCD de Alimentos y Salud, University College Dublin, Belfield, D04 V1W8, Irlanda

Amalia GM Scannell

Teagasc Food Research Centre, Ashtown, Dublín, D15 DY05, Irlanda

Brijesh K. Tiwari

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ABS conceptualizó el estudio, realizó experimentos con un dispositivo de luz ultravioleta, analizó la mayoría del trabajo experimental y escribió y editó el manuscrito original y las revisiones correspondientes. DE revisó y editó el manuscrito y realizó el análisis WGS y el análisis bioinformático junto con ABS, MM realizó y analizó experimentos relacionados con la formación de biopelículas y pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos y revisó y editó el manuscrito. AS, PW, DJB, CMB y BKT supervisaron el estudio y editaron y revisaron el manuscrito. BKT fue responsable de la administración del proyecto y la adquisición de fondos.

Correspondencia a Brijesh K. Tiwari.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Soro, AB, Ekhlas, D., Marmion, M. et al. Investigación de las diferencias en la susceptibilidad de las cepas de Campylobacter jejuni a la tecnología de diodos emisores de luz ultravioleta (UV-LED). Informe científico 13, 9459 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35315-0

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Recibido: 01 febrero 2023

Aceptado: 16 mayo 2023

Publicado: 10 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35315-0

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